Formation PCR Quantitative
Objectifs pédagogiques
- Présenter tous les paramètres des cinétiques d’amplification et de dissociation et de souligner leur importance dans les calculs de quantification
- Souligner l’impact du choix des amorces sur les résultats
- Rendre le design des amorces accessible
- Trouver une bonne stratégie pour gagner beaucoup de temps et d'efficacité
- Comprendre l’importance de la rigueur extrême nécessaire dans cette technique à chaque étape afin d'obtenir reproductibilité et fiabilité des résultats
Programme
- Analyse de la courbe de dissociation (Melting Curve Analysis), Etude de la cinétique d’amplification, Efficacité de la PCR
- Quantification par PCR en temps réel
- Stratégie de normalisation
- Les Résultats
- Publication et PCRQ : les MIQE
- Validation des microarray et PCRQ haut débit
- Différentes approches du génotypage ou polymorphisme en PCRQ
- Dessin des amorces de PCRQ
- Précautions et risques biologiques
- Mise en place d’un projet de quantification : les points à considérer
- Les équipements : thermocycleurs, circuit PCR, Nanodrop, bio analyseur
- Les consommables
- Les kits
- Protocoles et optimisation
- Echantillons, ARN, cDNA, ADN : nature, qualité, extraction, quantification, conservation
- La reverse transcription : Une étape clé à optimiser en permanence
- Le cDNA
- Détecter les inhibitions de la PCR
- Les amorces
- La gamme d’étalonnage
- Les contaminations et cross contaminations
- Programmation des runs
- Présentation du logiciel du StepOne Plus
- Analyse des runs – Savoir identifier les erreurs
- Le piège des (mauvais) algorithmes de détection du seuil
- Calcul et exploitation des résultats dans Excel
- Présentation d’outils gratuits pour les calculs ou la normalisation : REST, Bestkeeper
- Présentation d’outils bio-informatiques pour le design des amorces : HUGO, ENSEMBL, BLAST, UPL, Primer blast, Amplify etc.
- Bibliographie
Public et pré-requis
Personnels scientifiques et techniques
Contact
Dates et lieu des prochaines sessions
Du 12 au 14 octobre 2015 - organisé avec Fc3Bio
Du 20 au 22 juin 2016 - organisé avec Fc3Bio
Du 10 au 12 octobre 2016 - organisé avec Fc3Bio