AniRA Vectorologie
Présentation
AniRA-Vectorologie est intégrée dans la plateforme régionale AniRA labélisée IBiSA, membre de l’Infrastructure de Recherche nationale Celphedia.
AniRA-Vectorologie offre un savoir-faire technologique dans le domaine de la production de vecteurs retroviraux et lentiviraux destinés au transfert stable et efficace de séquences nucléiques (gène, ADNc, Sh/miARN) dans des lignées cellulaires, des cellules primaires difficilement transfectables (cellules souches, …) ou dans un organisme entier. Ce système de transfert est utilisé dans de nombreux domaines qui vont de la recherche fondamentale à la clinique. Les applications sont multiples :
- La surexpression de gènes ou l’expression ectopique de gènes
- Le knock-down de gènes par des vecteurs véhiculant des shRNAs
- L’expression ou le knock down régulé de gènes par des vecteurs lentiviraux inductibles
- L’édition du génome (CRISPR/Cas9)
La plateforme de vectorologie offre une expertise dans la production de lots de vecteurs rétro et lentiviraux bien caractérisés et prêts à l’emploi en confinement C2. Ces productions sont réalisées dans le respect strict des conditions de biosécurité édictées par le Haut Conseil des Biotechnologies (confinement C2 ou C3 pour la production) selon une chartre d'utilisation des services propre à la plateforme de vectorologie. La principale activité de la plateforme de vectorologie est la production de vecteurs sur la base de MLV, HIV-1 ou SIV.
Plus spécifiquement :
- Un conseil dans le choix des vecteurs, pour le clonage de gènes d’intérêt et pour le niveau de biosécurité des vecteurs.
- La production de vecteurs pour la surexpression de gènes endogènes ou l’expression ectopique d’un gène dans une lignée cellulaire.
- La production de vecteurs pour le KO de gènes par des vecteurs codant des shRNAs dirigés contre l’ARN du gène d’intérêt.
- La production de vecteurs de régulation d’expression de gènes ou conditionnant le KO de l’expression de gènes par des lentivecteurs inductibles.
- La production de vecteurs de niveaux de confinement C2 ou C3, ainsi que la titration basée sur l’expression d’une protéine rapportrice, par sélection avec un antibiotique et par Q-PCR.
- La formation en production de vecteurs sur demande individuelle et à titre exceptionnel.
- Un service de lentigenèse: le plateau est impliqué dans le service de transgenèse lentivirale afin de générer des souris transgéniques.
Plus de précision sur la transgenèse lentivirale
Citation de la SFR Biosciences sur les publications
Activités
- Production de lots de vecteurs rétroviraux (MLV, HIV-1 et SIV) en confinement L2 ou L3 :
- La production des vecteurs lentiviraux est réalisée par tri-transfection en suivant la méthode de transfection au phosphate de calcium, dans une lignée de cellules embryonnaires de rein (293T). Les trois plasmides utilisés codent respectivement pour:
- - La glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG).
- - Les protéines de structures et enzymatiques du virus (gag+pol).
- - Le vecteur viral codant pour un gène rapporteur (GFP).
shéma production d'un vecteur lentiviral.
- Concentration de virions
- Titration de particules virales infectieuses :
Par infection de cellules HEK293T suivie d'une des révélation suivante :
- Détection par cytométrie en flux (FACS), du vecteur grâce à un gène rapporteur codant pour un fluorochrome (GFP, mRFP, mKate,…),
- Sélection avec un antibiotique (puro, néo, zéo,…) grâce à un gène de résistance orésent dans le vecteur.
- Quantification du nombre de copies de génome intégré par QPCR (si les séquences rétrovirales sont compatibles avec nos conditions).
Nous proposons aussi une quantification des particules physiques par dosage de la protéine de capside p24/p27/p30 en test ELISA.
Description détaillée des modalités de production, validation et livraison des vecteurs
Pour toute demande de production de vecteurs, le demandeur doit remplir une demande et signer la « Charte d’utilisation des services de la Plateforme de Vectorologie »:
Aucune demande de production ne sera prise en compte sans :
- - Le Formulaire de demande (entièrement rempli sous format Word) envoyé par mail.
- - La description du vecteur avec sa carte détaillée (en version électronique pour soumission au HCB) avec le nom du gène formellement identifiable dans une base de données.
- - Le numéro d’agrément OGM / HCB.
Equipements
Les équipements de la plateforme comprennent entre autre :
-
- 1 Ultra centrifugeuse - Optima XE-90
- 2 Rotors SW41 et 1 SW32 Beckman
- 1 Centrifugeuse réfrigérée Allegra 25R Beckman
- 2 PSM type 2
- 2 Lots de pipettes Eppendorf
- 2 Incubateur Thermo BB15 (en P3 et en P2)
- 1 Lecteur de plaques ELISA
- 1 Bloc chauffant
- 1 Centrifugeuse à micro tubes réfrigérée Eppendorf 5427R
- 1 Centrifugeuse à micro tubes réfrigérée Eppendorff 5424R
- 1 Centrifugeuse réfrigérée 5804R – Eppendorf
- 1 Generateur d'élecrophorèse PS 304XL
- 1 Cuve MIDIGEL XL - Dutscher
- 1 Cuve Horizontal MIDIGEL2 - Dutscher
PERSONNEL MIS A DISPOSITION
COSTA FEJOZ Caroline IE2 Inserm CIRI (U1111) 100%
NEGRE Didier CR1 CNRS CIRI (U1111) 20%
FROMENT Gisèle TCS Inserm SFR Biosciences UMS3444/US8 100%
Contact/Localisation
Comment accéder aux plateaux - entrée de sites (en intranet)
La plateforme est hébergée par le CIRI (Centre International de Recherche en Infectiologie) U1111/UMR5308 Inserm-CNRS-UCBL - ENS de Lyon dans l'équipe EVIR située au rez de chaussée du M7 (ex LR5) de l'ENS de Lyon Site Monod :
- Bat. LR5 - Equipe: EVIR
- Ecole Normale Supérieure de Lyon
- 9 rue du Vercors
- 69007 Lyon
Pour tout renseignement, contactez :
- Caroline Costa Fejoz: responsable plateau
- Tel : 04 72 72 87 28
- Mail : caroline.costa@ens-lyon.fr
- Pour toute demande de production de vecteurs, merci de télécharger le fichier de demande de productions, le compléter et renvoyer au contact suivant : plateau.vectorologie@ens-lyon.fr
Formation
- Production de vecteurs rétroviraux: théorie, pratique et biosécurité (sur demande individuelle et à titre exceptionnel).
Tarifs
- Tarifs accessibles en intranet (équipes contributrices et équipes académiques) ou sur demande spécifique.
Documentation
Liens
- Guide 'O.G.M. en milieu confiné'
- Guide Haut Conseil aux Biotechnologies
- Un guide des risques biologiques (CNRS)