Il est indispensable de bien maitriser les aspects théoriques et techniques de la PCR Quantitative pour pouvoir générer des résultats fiables et reproductibles. La plateforme vous propose plusieurs modules de formation vous permettant d’appréhender  et comprendre les différents aspects de la technologie en accord avec les recommandations des MIQE (minimum requis pour la publication d’un papier QPCR et acquérir ainsi une bonne autonomie dans la gestion de vos projets QPCR.

Le plateau propose plusieurs modules de formation dont vous trouverez le descriptif ci-dessous

Les modules fondamentaux A, B et D  organisés plusieurs fois par an vous permettent de prendre en main la technologie QPCR de façon experte et  autonome.  Les annonces et les inscriptions se font par mail

Les autres modules se font à la demande sur rendez-vous (bariza.blanquier@inserm.fr)

A- PCR quantitative : Aspect théorique

Cette partie a pour but de présenter tous les paramètres des cinétiques d’amplification et de dissociation et de souligner leur importance dans les calculs de quantification.

1- Mesure du signal d’amplification par fluorescence :

Les sondes d’hybridation (Taqman et molecular beacon)

Le sybergreen

2- Analyse de la courbe de dissociation (Melting Curve Analysis) :

Définition du TM

Spécificité de séquence et TM de l’amplicon

Contaminations

Dimères d’amorces

Qualité et validation de la PCR

3- Etude de la cinétique d’amplification :

Identification et propriétés mathématiques de la phase exponentielle

Bruit de fond des fluorophores

Seuil de détection (Cp/Ct/Cq)

4- Efficacité de la PCR :

Définition et utilité E=10 -1/pente

Calcul de l’efficacité par régression linéaire d’une gamme de dilution

Validation des amorces : dynamique, linéarité et limite de détection

Standardisation et validation des manipulations de PCRQ (intra et inter-run)

Les contrôles indispensables

5- Quantification par PCR en temps réel :

ARN et ADN génomique

Quantification absolue

Quantification relative - Avec et sans correction d’efficacité (2ddCT)

Stratégie de quantification en fonction du contexte biologique

6- Stratégie de normalisation :

Définition des gènes de référence (housekeeping gene)

Choix et validation des gènes de référence : moyenne arithmétique ou géométrique ?

Les outils gratuits à connaître (Genorm, Bestkeeper, Rest)

7- les Résultats :

La reproductibilité

La sensibilité

La précision (exact /relatif)

Les réplicats techniques et biologiques

Présentation des résultats : Nombre de copies, comparatif, fold change, fold increase

Quelques logiciels à connaître ou paramétrer Excel ?

8- Publication et PCRQ :

Les MIQE (minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments ) ou le minimum requis pour la publication

B- PCR Quantitative : aspect pratique

Cette partie a pour but de souligner l’importance de la rigueur extrême nécessaire dans cette technique à chaque étape si l’on souhaite reproductibilité et fiabilité des résultats.

Les aspects pratiques présentés suivent les recommandations des MIQE.

- Précautions et risques biologiques

- Mise en place d’un projet de quantification : les points à considérer

- Les équipements : thermocycleurs, circuit PCR, Nanodrop, bio analyseur

- Les consommables

- Les kits

Protocoles et optimisation

Echantillons, ARN, cDNA, ADN : nature, qualité, extraction, quantification, conservation

La reverse transcription : Une étape clé à optimiser en permanence

Quantité ARN

Le traitement à la Dnase

Les différentes enzymes

La stratégie d’amorçage et sensibilité détection

(oligotDT random primers ou amorce spécifique)

Rendement de la RT et vérification

Les contrôles de RT

Les kits de RT

Le cDNA

Détecter les inhibitions de la PCR

Les amorces

La gamme d’étalonnage

Les contaminations et cross contaminations

C- Différentes approches du génotypage ou polymorphisme en PCRQ (Sur RDV)

Les sondes d’hybridation

La PCR digitale

Le HRM (High Resolution Melt Analysis)

D- Dessin des amorces de PCRQ (sur RDV)

La qualité des amorces est un point clé de la PCR en temps réel. Cette partie a pour but d’en souligner l’impact sur les résultats de rendre le design accessible et prouver qu’avec une bonne stratégie on gagne beaucoup en temps et en efficacité.

Pourquoi il est (toujours) préférable de dessiner soi-même les amorces :

Stratégie efficace de design en 5 étapes faciles :

HUGO nomenclature du gène et portail bio-info

ENSEMBL : connaître son gène pour définir la séquence à amplifier

Organisation intron exon ; séquences codantes,UTR , SNIP; isoformes

Logiciels et outils de design

- Beacon designer : pourquoi c’est le meilleur .BLAST et MFOLD

Les paramètres à spécifier pour les amorces et les amplicons

- UPL de Roche

- Primer Blast

- Les banques d’oligonucléotides

Amplify : la PCR électronique très prédictive et gratuite

Commande, test et validation des oligos

E- Analyse et exploitation des résultats : (sur RDV)

Programmation et Analyse des runs : exploration des logiciels des instruments de la plateforme

Calcul et exploitation dans Excel.

Présentation d’outils gratuits pour les calculs ou la normalisation : REST, Bestkeeper, Genorm.