Formations
Il est indispensable de bien maitriser les aspects théoriques et techniques de la PCR Quantitative pour pouvoir générer des résultats fiables et reproductibles. La plateforme vous propose plusieurs modules de formation vous permettant d’appréhender et comprendre les différents aspects de la technologie en accord avec les recommandations des MIQE (minimum requis pour la publication d’un papier QPCR et acquérir ainsi une bonne autonomie dans la gestion de vos projets QPCR.
Le plateau propose plusieurs modules de formation dont vous trouverez le descriptif ci-dessous
Les modules fondamentaux A, B et D organisés plusieurs fois par an vous permettent de prendre en main la technologie QPCR de façon experte et autonome. Les annonces et les inscriptions se font par mail
Les autres modules se font à la demande sur rendez-vous (bariza.blanquier@inserm.fr)
A- PCR quantitative : Aspect théorique
Cette partie a pour but de présenter tous les paramètres des cinétiques d’amplification et de dissociation et de souligner leur importance dans les calculs de quantification.
1- Mesure du signal d’amplification par fluorescence :
Les sondes d’hybridation (Taqman et molecular beacon)
Le sybergreen
2- Analyse de la courbe de dissociation (Melting Curve Analysis) :
Définition du TM
Spécificité de séquence et TM de l’amplicon
Contaminations
Dimères d’amorces
Qualité et validation de la PCR
3- Etude de la cinétique d’amplification :
Identification et propriétés mathématiques de la phase exponentielle
Bruit de fond des fluorophores
Seuil de détection (Cp/Ct/Cq)
4- Efficacité de la PCR :
Définition et utilité E=10 -1/pente
Calcul de l’efficacité par régression linéaire d’une gamme de dilution
Validation des amorces : dynamique, linéarité et limite de détection
Standardisation et validation des manipulations de PCRQ (intra et inter-run)
Les contrôles indispensables
5- Quantification par PCR en temps réel :
ARN et ADN génomique
Quantification absolue
Quantification relative - Avec et sans correction d’efficacité (2ddCT)
Stratégie de quantification en fonction du contexte biologique
6- Stratégie de normalisation :
Définition des gènes de référence (housekeeping gene)
Choix et validation des gènes de référence : moyenne arithmétique ou géométrique ?
Les outils gratuits à connaître (Genorm, Bestkeeper, Rest)
7- les Résultats :
La reproductibilité
La sensibilité
La précision (exact /relatif)
Les réplicats techniques et biologiques
Présentation des résultats : Nombre de copies, comparatif, fold change, fold increase
Quelques logiciels à connaître ou paramétrer Excel ?
8- Publication et PCRQ :
Les MIQE (minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments ) ou le minimum requis pour la publication
B- PCR Quantitative : aspect pratique
Cette partie a pour but de souligner l’importance de la rigueur extrême nécessaire dans cette technique à chaque étape si l’on souhaite reproductibilité et fiabilité des résultats.
Les aspects pratiques présentés suivent les recommandations des MIQE.
- Précautions et risques biologiques
- Mise en place d’un projet de quantification : les points à considérer
- Les équipements : thermocycleurs, circuit PCR, Nanodrop, bio analyseur
- Les consommables
- Les kits
Protocoles et optimisation
Echantillons, ARN, cDNA, ADN : nature, qualité, extraction, quantification, conservation
La reverse transcription : Une étape clé à optimiser en permanence
Quantité ARN
Le traitement à la Dnase
Les différentes enzymes
La stratégie d’amorçage et sensibilité détection
(oligotDT random primers ou amorce spécifique)
Rendement de la RT et vérification
Les contrôles de RT
Les kits de RT
Le cDNA
Détecter les inhibitions de la PCR
Les amorces
La gamme d’étalonnage
Les contaminations et cross contaminations
C- Différentes approches du génotypage ou polymorphisme en PCRQ (Sur RDV)
Les sondes d’hybridation
La PCR digitale
Le HRM (High Resolution Melt Analysis)
D- Dessin des amorces de PCRQ (sur RDV)
La qualité des amorces est un point clé de la PCR en temps réel. Cette partie a pour but d’en souligner l’impact sur les résultats de rendre le design accessible et prouver qu’avec une bonne stratégie on gagne beaucoup en temps et en efficacité.
Pourquoi il est (toujours) préférable de dessiner soi-même les amorces :
Stratégie efficace de design en 5 étapes faciles :
HUGO nomenclature du gène et portail bio-info
ENSEMBL : connaître son gène pour définir la séquence à amplifier
Organisation intron exon ; séquences codantes,UTR , SNIP; isoformes
Logiciels et outils de design
- Beacon designer : pourquoi c’est le meilleur .BLAST et MFOLD
Les paramètres à spécifier pour les amorces et les amplicons
- UPL de Roche
- Primer Blast
- Les banques d’oligonucléotides
Amplify : la PCR électronique très prédictive et gratuite
Commande, test et validation des oligos
E- Analyse et exploitation des résultats : (sur RDV)
Programmation et Analyse des runs : exploration des logiciels des instruments de la plateforme
Calcul et exploitation dans Excel.
Présentation d’outils gratuits pour les calculs ou la normalisation : REST, Bestkeeper, Genorm.